鼻腔不仅是流感病毒进入人体的第一道门户，也可能是重要的免疫记忆驻留地。

近日发表于《Journal of Experimental Medicine》的一项研究发现，流感感染后，鼻腔组织中能够形成长期驻留的CD4⁺组织驻留记忆T细胞（tissue-resident memory T cells，TRM）。这些细胞能够在再次遭遇不同流感病毒亚型时发挥局部保护作用。

研究还发现，鼻腔CD4⁺ TRM与肺部同类细胞具有明显不同的转录特征，其中具有Th17特征的细胞在鼻腔中占比较高，并参与病毒清除和组织损伤控制。

流感免疫，为什么不能只看抗体？

流感病毒表面的抗原会不断发生变化，这也是流感疫苗需要持续更新的重要原因之一。相比之下，T细胞能够识别病毒内部相对保守的抗原，因此可能保留对不同病毒亚型的部分交叉识别能力。

近年来，组织驻留记忆T细胞逐渐受到关注。与循环于血液中的记忆T细胞不同，TRM能够长期驻留在特定组织中。对于呼吸道病毒而言，这意味着：免疫记忆可能并不只是存在于血液中，而是直接“驻扎”在病毒最先进入人体的组织。

那么，流感感染后，鼻腔中是否也会形成长期存在的CD4⁺ TRM？这些细胞又是否能够在再次感染时提供保护？这正是本研究关注的问题。

研究发现：鼻腔中存在长期驻留的CD4⁺ TRM

研究人员利用流感感染模型，对鼻腔组织中的CD4⁺ TRM进行了系统研究。结果显示，流感感染后，鼻腔中能够形成针对流感病毒抗原的CD4⁺ TRM，而且这些细胞能够在感染结束后持续存在。

进一步比较发现，鼻腔CD4⁺ TRM与肺部CD4⁺ TRM具有不同的转录特征。这说明，TRM并不是一种完全相同的“通用记忆细胞”。相同类型的免疫细胞进入不同组织后，会受到局部微环境影响，形成具有组织特异性的细胞状态。对于呼吸道免疫而言，这一点尤其重要——鼻腔和肺部可能承担着不同的免疫功能。

再次感染时，鼻腔TRM能够提供交叉保护

研究人员进一步进行了异源亚型流感病毒攻击实验，即再次感染时使用与初次感染不同的流感病毒亚型。结果显示，既往感染形成的鼻腔CD4⁺ TRM能够参与再次感染时的局部免疫反应，并帮助控制病毒。

这提示鼻腔中的免疫记忆可能具有一定的跨亚型保护能力。这种保护并不意味着完全阻止病毒感染，而更可能表现为在病毒进入后，利用已经存在于局部组织中的免疫细胞快速响应，从而促进病毒清除。因此，相比单纯关注血液中的抗体和循环免疫细胞，呼吸道黏膜本身的免疫记忆同样值得关注。

单细胞技术揭示：鼻腔TRM并不是一种细胞

传统流式细胞术可以帮助研究人员判断CD4⁺ TRM的数量和表型，但如果进一步想了解这些细胞处于什么状态？不同细胞之间有什么差异？哪些细胞可能参与保护？鼻腔TRM与肺部TRM为什么不同？就需要更高维度的分析手段。因此，研究进一步采用单细胞RNA测序分析鼻腔和肺部CD4⁺ TRM。

结果显示，鼻腔CD4⁺ TRM具有明显的细胞异质性，并呈现出不同于肺部TRM的转录特征。其中一个值得关注的群体，是具有Th17特征的CD4⁺ TRM。研究发现，这类细胞在鼻腔中占比较高，并能够产生IL-17，参与局部病毒清除以及组织损伤控制。

研究人员进一步在人类鼻腔组织中观察到了较高比例的Th17型CD4⁺ TRM，为动物实验结果提供了人类样本层面的支持。

这些细胞为什么能够长期驻留在鼻腔？

研究还进一步探索了CD4⁺ TRM在鼻腔中的驻留机制。结果提示，CXCR6–CXCL16信号轴参与了鼻腔CD4⁺ TRM的组织驻留。这意味着，TRM并不是随机停留在组织中的T细胞。它们的形成、定位和长期维持，与特定的分子信号以及局部组织微环境密切相关。因此，要真正理解组织驻留记忆T细胞，不仅需要知道“有哪些细胞”，还需要进一步了解：这些细胞为什么出现在这里，以及它们如何长期维持。

从单细胞测序看，样本制备同样重要

这项研究采用了单细胞RNA测序等技术，对不同来源的CD4⁺ TRM进行精细分析。但在进入单细胞建库之前，还有一个非常关键的环节：如何处理这些数量有限的目标细胞？研究人员需要从鼻腔组织中分离并分选特定的免疫细胞。其中部分目标细胞群数量仅有千余个。

对于这样的低细胞量样本，每一个细胞都十分珍贵。如果采用传统反复离心、吸液和重悬的方式进行洗涤，细胞可能经历额外的机械扰动，同时也存在细胞损失的风险。因此，对于单细胞研究而言，洗涤并不是简单的“换液”。它实际上是从有限起始细胞到高质量单细胞输入之间的重要样本制备环节。

C-Free™：为低细胞量样本提供温和洗涤

本研究中，研究人员使用Curiox C-Free™ 层流洗涤Mini系统对分选后的细胞进行洗涤，随后进入单细胞分析流程。与传统离心洗涤不同，层流洗涤通过受控液体流动完成洗涤，不依赖反复离心和重悬。对于低细胞量、分选后的珍贵细胞，这种样本制备方式的价值主要体现在：减少反复离心带来的机械扰动；降低洗涤过程中可能产生的细胞损失；尽可能保留进入后续单细胞分析流程的有效细胞。

从实验流程来看，可以将其理解为：组织取样 → 细胞分离 → 流式分选 → C-Free™洗涤 → 单细胞建库 → 测序与数据分析

在这一过程中，温和、稳定的样本洗涤，为后续高维度分析提供了重要的细胞基础。

从“高维检测”到“高质量样本”：单细胞研究的另一条主线

这项研究最终揭示的是鼻腔CD4⁺ TRM在流感交叉保护中的作用，但从实验流程来看，还体现了另一个值得关注的问题：高维分析的质量，不仅取决于测序平台和数据分析算法，也取决于进入分析体系之前的细胞状态。尤其对于：稀有免疫细胞、组织来源细胞、流式分选后的细胞、低细胞量样本、单细胞测序样本，样本制备过程中的细胞损失和状态变化，都可能影响最终获得的数据。

因此，在单细胞和高参数免疫分析越来越普及的今天，样本制备正在成为连接“细胞”与“数据”的重要环节。

这项研究对黏膜免疫研究意味着什么？

过去评价流感免疫时，我们更多关注血液中的抗体和免疫细胞。而这项研究进一步提示：真正最先接触病毒的鼻腔，本身就是一个重要的免疫记忆空间。鼻腔CD4⁺ TRM能够长期驻留，并在再次感染时参与局部免疫反应；其中Th17型TRM可能在病毒清除和组织保护中发挥重要作用。

这些发现也为未来研究黏膜疫苗、呼吸道病毒感染以及组织驻留免疫提供了新的思路。更重要的是，随着单细胞测序、单细胞多组学等技术不断发展，研究人员能够从“有多少细胞”，进一步走向：

这些细胞是谁？

它们处于什么状态？

它们为什么驻留在这里？

它们如何参与保护性免疫？

而这些问题的答案，都建立在高质量细胞样本的基础之上。

结语

这项研究揭示了一个重要的免疫学现象：抵御流感的免疫记忆，并不只存在于血液和淋巴系统中。鼻腔组织中同样存在能够长期驻留的CD4⁺记忆T细胞，它们具有明显的组织特异性，并能够在再次遭遇不同流感病毒亚型时参与局部保护。

与此同时，这项研究也展示了单细胞研究中容易被忽视的一环——样本制备。从稀有细胞分选，到温和洗涤，再到单细胞建库，每一步都可能影响最终的数据质量。

本研究中，研究人员使用Curiox Laminar Wash完成分选细胞的洗涤，为后续单细胞分析提供样本制备支持。从鼻腔免疫到单细胞分析，从稀有细胞到高维数据，高质量的免疫研究始于对每一个细胞的妥善处理。

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